为什么要筛选转录因子的互作蛋白

1. 为什么要筛选转录因子的互作蛋白

一、拟南芥转录因子文库筛选理论基础
微如草芥，却贡献巨大的模式植物——拟南芥拥有有5对染色体，1.25亿个碱基对，编码着2.5万个基因，据拟南芥转录因子数据库（DATF）统计，可查询2290个转录因子。
我们通过构建酵母文库单杂筛选或者DNA pulldown来筛选转录因子时，会发现捕获的转录因子数量特别少，甚至没有转录因子，这2000多个转录因子到哪里去了？
转录因子是一类周期性调控蛋白，只有在特定的生长时期，特定的组织部位才会有一定丰度的表达。其功能如同手枪的“扳机”，电路的“开关”。微量表达就能调控下游靶基因，改变生物性状。功能如此强大的转录因子，如神龙见首不见尾的大侠，只有在“需要”的时候，偶露峥嵘。
构建酵母单杂文库时，即使选择建库材料时遵循了跨时空的原则，能够囊括的转录因子基因依然很少，筛不到靶标转录因子实属正常。
北京大学邓兴旺院士团队针对这种状况，将拟南芥中出现频率较高的1500多种转录因子调取出来，组成转录因子文库，避开了时空效应，这是最“土”的手段，却是科研路上最“聪明”的策略。
转录因子文库的实验设计和实验方法见刊于《Molecular Plant》题为“A high-throughput screening system for Arabidopsis Transcription factors and its application to Med25-dependent tranional regulation

2. 如何排除一个蛋白是否是一个基因的转录因子

1你要纯化蛋白并对其进行序列和结构分析，
2你要将蛋白的和DNA的结合部位找到（ChIP可以做到，需要的是能制备蛋白的抗体）
3 酵母单杂交，在报告基因上游克隆你的蛋白结合的启动子，将你的目标蛋白加入体系看能否表达，表达就说明是转录因子，否则不是。
当然，可能你的目标蛋白不能和DNA结合，那么你在做ChIP的时候就会发现没有DNA与蛋白的结合，也可能你的蛋白只和DNA结合但不能激活转录的起始，这就需要你通过蛋白的结构将蛋白质的DNA结合区与一广谱转录激活因子结合，从而验证其功能。
ChIP：染色体免疫共沉淀
第一步：用甲醛在体内将DNA结合蛋白与DNA交联
第二步：分离染色体（质），剪切后的DNA小片段与结合蛋白结合
第三步：用特异性抗体与DNA结合蛋白结合，用沉淀法分离复合体。反向交联操作释放出DNA，并消化蛋白质
第四步：用PCR扩增特异DNA序列，以确定是否与抗体共沉淀

3. 如何实验证明某一蛋白影响某一转录因子

如何实验证明某一蛋白影响某一转录因子
怎么证明一个蛋白是转录因子
从你的描述来看，是要做功能研究。有这样几个思路：

第一，先分析该蛋白的氨基酸序列，看有无DNA结合区。和其他的转录因子有无功能同源区。
第二，证实该蛋白有转录活性。分别overexpress或者silence后，做差减PCR，筛查下游基因。
第三，证实该蛋白有DNA结合能力。找到下游基因，或者发现同源转录因子后，做gel shift 实验。

4. 如何实验证明某一蛋白影响某一转录因子

如何实验证明某一蛋白影响某一转录因子
怎么证明一个蛋白是转录因子
从你的描述来看，是要做功能研究。有这样几个思路：
第一，先分析该蛋白的氨基酸序列，看有无DNA结合区。和其他的转录因子有无功能同源区。
第二，证实该蛋白有转录活性。分别overexpress或者silence后，做差减PCR，筛查下游基因。
第三，证实该蛋白有DNA结合能力。找到下游基因，或者发现同源转录因子后，做gel
shift
实验。

5. 基因转录的转录因子

6. 如何检测转录因子之间的相互作用

多国科学家组成的研究小组日前成功绘制了人体正常细胞中转录因子之间相互发挥作用的示意图。

研究人员调查了人体约2000种转录因子中的1222种。在这份示意图中，转录因子用点来表示，如果两种转录因子之间存在相互作用，就用线条把相应的两个点连接起来。最终，所有的连接工作结束后，画面出现一个大致的圆形。

有了这份示意图，转录因子之间复杂的关系可以较清楚地呈现在人们面前。研究人员表示，只要拥有必要的数据，癌细胞中转录因子之间的相互作用也能够通过图形表现出来，以帮助专家推测癌细胞基因的活动。

7. 转录因子的作用

是通过和顺式因子的互作来实现的。这段序列可以和转录因子的DNA结合域实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。目前，人工转录因子(Artificial Transcription Factor，ATF)的构建已用于转录因子的生物学功能研究中起到重要作用。ATF是指将不同的DNA结合结构域与效应结构域组合在一起，人为地构建具有新的序列特异性与作用效果的转录因子 ，在基础研究、药物设计以及基因治疗等领域得到了广泛研究，目前研究较多的ATF主要为C2H2型锌指结构。

8. 转录因子的作用

问题一：何为转录？转录因子的主要功效有哪些？  以DNA为模板合成RNA的过程，转录因子是转录的起始者，是定位于细胞核的蛋白质，与核基因的启动子区特定的序列结海，结合后启动转录的过程。 
  
   问题二：什么是转录因子，有什么生理意义  真核生物转录起始十分复杂，往往需要多种蛋白因子的协助，转录因子与RNA聚合酶Ⅱ形成转录起始复合体，共同参与转录起始的过程。根据转录因子的作用特点可分为二类；第一类为普遍转录因子,它们与RNA聚合酶Ⅱ共同组成转录起始复合体时，转录才能在正确的位置开始。除TFⅡD以外，还发现TFⅡA，TFⅡF，TFⅡE，TFⅡH等，它们在转录起始复合体组装的不同阶段起作用。第二类转录因子为组织细胞特异性转录RNA的转录合成从化学角度来讲类似于DNA的复制，多核苷酸链的合成都是以5’→3’的方向，在3’-OH末端与加入的核苷酸磷酸二酯键，但是，由于复制和转录的目的不同，转录又具有其特点：（1）对于一个基因组来说，转录只发生在一部分基因，而且每个基因的转录都受到相对独立的控制（图17-2）；（2）转录是不对称的。（3）转录时不需要引物，而且RNA链的合成是连续的。 
  
   问题三：转录因子包括什么主要的功能结构域  顺式作用元件存在于基因旁侧序列中，包括启动子，增强子等，它本身不编码任何产物，只是提供一个作用位点，要与反式作用因子结合才起作用。而反式作用因子就是参与基因表达调控的蛋白质因子，与顺式作用元件结合起作用，有两个功能结构域：DNA结合结构域和转录活化结构域。 
  
   问题四：转录因子包括什么主要的功能结构域  转录因子结构可包含有不同区域：①DNA结合域（DNA binding domain），多由60-100个氨基酸残基组成的几个亚区组成；②转录激活域（activating domain），常由30-100氨基酸残基组成，这结构域有富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同种类，一酸性结构域最多见；③连接区，即连接上两个结构域的部分。不与DNA直接结合的转录因子没有DNA结合域，但能通过转录激活域直接或间接作用与转录复合体而影响转录效率。 
  
   问题五：转录激活因子与转录因子的区别  1.转录激活因子是一个转录因子家族，通过识别和结合环腺苷酸应答元件而激活基因表达。 
  2.转录激活因子与特定DNA序列结合以促进基因转录的因子。 
  转录因子是一群能与基因5`端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。 
  转录因子与RNA聚合酶Ⅱ形成转录起始复合体，共同参与转录起始的过程。根据转录因子的作用特点可分为二类； 
  第一类为普遍转录因子,它们与RNA聚合酶Ⅱ共同组成转录起始复合体时，转录才能在正确的位置开始。除TFⅡD以外，还发现TFⅡA，TFⅡF，TFⅡE，TFⅡH等，它们在转录起始复合体组装的不同阶段起作用。 
  第二类转录因子为组织细胞特异性转录因子，这些TF是在特异的组织细胞或是受到一些类固醇激素\生长因子或其它 *** 后，开始表达某些特异蛋白质分子时，才需要的一类转录因子。 
  作用 
  是通过和顺式因子的互作来实现的。这段序列可以和转录因子的DNA结合域实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。 
  目前，人工转录因子的构建已用于转录因子的生物学功能研究中起到重要作用。ATF是指将不同的DNA结合结构域与效应结构域组合在一起，人为地构建具有新的序列特异性与作用效果的转录因子 ，在基础研究、药物设计以及基因治疗等领域得到了广泛研究，目前研究较多的ATF主要为C2H2型锌指结构。 
  
   问题六：转录因子包括什么主要的功能结构域？其主要的结构特点与功能是什么  作为蛋白质的转录因子从功能上分析其结构可包含有不同区域：①DNA结合域（DNA binding domain）,多由60-100个氨基酸残基组成的几个亚区组成；②转录激活域（activating domain）,常由30-100氨基酸残基组成,这结构域有富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同种类,一酸性结构域最多见；③连接区,即连接上两个结构域的部分.不与DNA直接结合的转录因子没有DNA结合域,但能通过转录激活域直接或间接作用与转录复合体而影响转录效率. 
  与DNA结合的转录因子大多以二聚体形式起作用,与DNA结合的功能域常见有以几种： 
  ①螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix,HTH）及 螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH） 
  这类结构至少有两个α螺旋其间由短肽段形成的转角或环连接,两个这样的motif结构以二聚体形式相连,距离正好相当于DNA一个螺距(3.4nm）,两个α螺旋刚好分别嵌入DNA的深沟. 
  ②锌指（zinc finger） 其结构如图 所示,每个重复的“指”状结构约含23个氨基酸残基,锌以4个配价键与4个半胱氨酸、或2个半胱氨酸和2个组氨酸相结合.整个蛋白质分子可有2-9个这样的锌指重复单位.每一个单位可以其指部伸入DNA双螺旋的深沟,接触5个核苷酸.例如与GC盒结合的转录因子SP1中就有连续的3个锌指重复结构. 
  ③碱性-亮氨酸拉链（basic leucine zipper,bZIP） 这结构的特点是蛋白质分子的肽链上每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基,结果就导致这些亮氨酸残基都在α螺旋的同一个方向出现.两个相同的结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结合成二聚体,这二聚体的另一端的肽段富含碱性氨基酸残基,借其正电荷与DNA双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合.若不形成二聚体则对DNA的亲和结合力明显降低.在肝脏、小肠上皮、脂肪细胞和某些脑细胞中有称为C/EBP家族的一大类蛋白质能够与CAAT盒和病毒增强子结合,其特征就是能形成bZIP二聚体结构. 
  
   问题七：什么是转录因子  能够结合在某基因上游特异核苷酸序列上的蛋白质，活化后从胞质转位至胞核珐通过识别和结合基因启动子区的顺式作用元件,启动和调控基因表达 
  
   问题八：如何证实转录因子与启动子作用  一般有体外和体内两种较为常用的方法：体外：用EMSA通常将纯化的蛋白和32P同位素标记的DNA探针（取promoter部分）一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针.DNA-复合物比非结合的探针移动得慢....